Что происходит с материалом в лаборатории,

или из чего складываются сроки гистологического исследования.

Данная статья будет полезна для ветеринарных врачей и владельцев животных, которые хотят узнать сколько делается гистологическое исследование, а также почему в разных лабораториях могут быть разные сроки.

Сразу следует отметить, что здесь мы говорим только о технических процессах и не учитываем логистику, которая, в некоторых случаях, может составлять более половины срока исследования (например, при отправке в другую страну).

Сроки гистологического исследования в Science Vet без лишнего текста.

Итак, после того как материал был получен, в лаборатории происходит его регистрация: присвоение регистрационного номера и внесение данных в журнал регистрации гистологического материала.

Далее, необходимо сделать вырезку, т.е. от присланного органа или крупного кусочка ткани ветеринарный врач вырезает наиболее информативную область.

Фото 1. Фрагмент кожи собаки с новообразованием

После этого, вырезанный материал отправляется на обязательную дофиксацию в 10%-ном формалине на 24 ч.

Если орган или ткань присланы в нефиксированном виде, то ткань фиксируется 24-48 часов до вырезки и ещё 24 часа после.

Также если материал содержит костную ткань, зубы, то для корректного исследования требуется его декальцинация (удаление неорганических солей кальция). Существуют различные жидкости для данных целей. В настоящее время мы в Science Vet используем электролитную декальцинирующую жидкость.

Для очень маленьких костных фрагментов достаточно 1 часа, для фаланги пальца кошки около 24 часов.

Костная ткань, зубы, крупные очаги обызвествления нуждаются в декальцинации в течение 1-24 часа. Зубы декальцинируются дольше костной ткани.

Фото 2. Премоляр кошки. Ув. 40+камера; окраска гематоксилин-эозин

Такой гистологический препарат зуба можно получить только после проведения качественной декальцинации.

Затем следует процесс обезвоживания в спиртах возрастающей крепости. Это необходимо, чтобы материал в дальнейшем пропитался парафином и возможно было сделать гистологический блок. Для обезвоживания можно использовать этиловый, либо изопропиловый спирт.

Мы, как и многие гистологические лаборатории в настоящее время, используем изопропиловый спирт.

Следующий этап - пропитывание парафином и заливка материала, т.е. изготовление гистологического блока.

Существует множество протоколов гистологической проводки. Длительность экспозиции в каждом спирте зависит от многих факторов: наличия/отсутствия гистопроцессора, вида ткани, вида животного, качества используемого спирта и т.д.

Данный процесс, в зависимости от перечисленных условий может занимать от 5 часов до 5 дней. Разброс очень большой, поэтому требует пояснений.

Самая высокая скорость проводки будет при наличии в лаборатории гистопроцессора вакуумного или карусельного типа. В зависимости от выбранной программы весь процесс от фиксированного кусочка до гистологического блока займет 3-24 часа.

Фото 3. Вакуумный гистопроцессор. Фото взято из свободных источников

Фото 4. Карусельный гистопроцессор. Фото взято из свободных источников

При отсутствии данного оборудования производится ручная проводка материала (т.е. фрагменты материала вручную переносятся из одной жидкости в другую). При таком способе, в зависимости от выбранного протокола, время изготовления блока увеличивается и возрастает до 3-5 суток.

Вот несколько возможных протоколов проводки:

1. Для вакуумного процессора (взято отсюда https://vk.com/wall-64887952_5051)

1. Формалин 1 ч 37 oC

2. Изопреп, 40 минут 37 оC 3. Изопреп, 40 минут 37 оC 4. Изопреп, 50 минут 37 оC 5. Изопреп, 50 минут 37 оC 6. Изопреп, 60 минут 37 оC 7. Изопреп, 60 минут 37 оC 8. Изопреп, 1 час 10 минут 37 оC 9. Изопреп, 1 час 10 минут 37 оC 10. Парафин, 1 ч. 11. Парафин, 1 ч. 12. Парафин, 1 ч. 13. Парафин, 1 ч.

2. Проводка для процессора карусельного типа (взято отсюда http://histology.sudmed.ru/provodka-v-izopropanole.html)

3. Для ручной проводки (взято отсюда http://www.labtech.bio/uploads/1279_проводка%20на%20изопропаноле%20ручная.pdf)

Как видно из этих примеров, время приготовления гистологического блока может заметно отличаться в зависимости от оснащенности лаборатории и организации работы.

В Science Vet, с учетом особенностей рутинного материала, ручного метода и применяемых реактивов, мы используем следующий протокол гистологической проводки:

I. Для рутинного хорошо зафиксированного материала :

1. Вырезка, затем формалин - 24 ч

2. Изопропанол 50% - 2 ч

3. Изопропанол 75% - 3 ч

4. Изопропанол 90% - 16 ч (на ночь)

5. Изопропанол абс. - 2 ч

6. Изопропанол абс. - 3 ч

7. Парафин I 57 оС - 16 ч (на ночь)

8. Парафин II 57 оС - 2 ч

Это стандартный протокол, который может незначительно меняться в зависимости от особенностей органа или ткани. Например, для полнокровной селезенки увеличивается время пропитывания в парафине на 4-12 часов.

II. Для рутинного недостаточно фиксированного материала:

1. Формалин - 24 ч

2. Вырезка, затем формалин 24-48 ч

3. Изопропанол 50% - 2 ч

4. Изопропанол 75% - 3 ч

5. Изопропанол 90% - 16 ч (на ночь)

6. Изопропанол абс. - 2 ч

7. Изопропанол абс. - 3 ч

8. Парафин I 57 оС - 16 ч (на ночь)

9. Парафин II 57 оС - 2 ч

III. Для костной ткани и зубов:

1. Формалин 24 ч

2. Декальцинация 1-24 ч (зависит от размера фрагмента)

3. Промывка в воде 4-6 часов

4. Изопропанол 50% - 2 ч

5. Изопропанол 75% - 3 ч

6. Изопропанол 90% - 16 ч (на ночь)

7. Изопропанол абс. - 2 ч

8. Изопропанол абс. - 3 ч

9. Парафин I 57 оС - 16 ч (на ночь)

10. Парафин II 57 оС - 2 ч

Застывание блоков занимает 2-3 часа.

Фото 5. Гистологический блок.

Фрагмент новообразования с фото 1, залитый в парафин.

После изготовления блоков следует микротомия, т.е. получение тонких срезов ткани, залитой в парафин. Процесс относительно быстрый. На один блок уходит от 2 до 10 минут.

Приготовленные срезы помещаются на стекло с адгезивом и каплей воды. Срезам на стекле необходимо дать высохнуть. Здесь в разных лабораториях поступают по-разному: кто-то ускоренно сушит при 56 оС, кто-то оставляет на воздухе на несколько часов, кто-то кладет в термостат при 37 оС на ночь. Мы используем последний метод, т.к., на наш взгляд, это самый надежный способ предотвратить отклеивание срезов от стекла при дальнейшей окраске.

Следующий этап - окраска. Стандартный метод окраски гематоксилином и эозином занимает 50 минут. При необходимости применения дополнительных методов окраски, делается большее количество стекол и окрашивается в соответствии с протоколом. Обычно мы делаем сразу несколько стекол на этапе микротомирования, чтобы не тратить время в дальнейшем.

Фото 6. Гистологический препарат.

Срезы, полученные с блока на фото 5.

Однако бывает, когда требуется больше препаратов, например, обнаруживается сложный, неформатный случай.

Фото 7. Кавернозная гемангиома. Ув. х 100+камера; гематоксилин-эозин

Итоговый результат: изучив гистологический препарат (фото 6), сделанный с новообразования на фото 1, ветеринарный врач поставил диагноз - кавернозная гемангиома кожи.

Заключительный этап - это просмотр готового гистологического препарата ветеринарным врачом и оформление заключения. Обычно это занимает от 5 минут до 3-х часов, опять же, в зависимости от сложности случая.

Подведем итоги.

Сроки гистологического исследования в лаборатории Science Vet:

I. Для рутинного хорошо зафиксированного материала :

1. Вырезка, затем формалин - 24 ч

2. Изопропанол 50% - 2 ч

3. Изопропанол 75% - 3 ч

4. Изопропанол 90% - 16 ч (на ночь)

5. Изопропанол абс. - 2 ч

6. Изопропанол абс. - 3 ч

7. Парафин I 57 оС - 16 ч (на ночь)

8. Парафин II 57 оС - 2 ч

4 дня + 1 день изготовление препаратов+ 1 день окраска, постановка диагноза и оформление заключения = 6 дней.

II. Для рутинного недостаточно фиксированного материала:

1. Формалин - 24 ч

2. Вырезка, затем формалин 24-48 ч

3. Изопропанол 50% - 2 ч

4. Изопропанол 75% - 3 ч

5. Изопропанол 90% - 16 ч (на ночь)

6. Изопропанол абс. - 2 ч

7. Изопропанол абс. - 3 ч

8. Парафин I 57 оС - 16 ч (на ночь)

9. Парафин II 57 оС - 2 ч

5-6 дней+ 1 день изготовление препаратов+ 1 день окраска, постановка диагноза и оформление заключения = 8-9 дней.

III. Для костной ткани и зубов:

1. Формалин 24 ч

2. Декальцинация 1-24 ч (зависит от размера фрагмента)

3. Промывка в воде 4-6 часов

4. Изопропанол 50% - 2 ч

5. Изопропанол 75% - 3 ч

6. Изопропанол 90% - 16 ч (на ночь)

7. Изопропанол абс. - 2 ч

8. Изопропанол абс. - 3 ч

9. Парафин I 57 оС - 16 ч (на ночь)

10. Парафин II 57 оС - 2 ч

5-7 дней+ 1 день изготовление препаратов+ 1 день окраска, постановка диагноза и оформление заключения = 8-10 дней.

Итак, вилка в сроках исследования при наших реактивах и оснащенности составляет 6-10 дней. На данном этапе нашей работы самый частый вариант - вариант II.

Как видите, многое зависит от качества фиксации. А как приблизиться к идеальной фиксации можно посмотреть в нашем вебинаре.

Все ссылки на источники приведены в тексте.